核糖核酸/外泌体

 Veronica Dimuccio, Andrea Ranghino, Giovanni Camussi, and Benedetta Bussolati (2012) 正常尿液的外泌体隔离，计数和鉴定，Nephrol. Dial. Transplant. (2012) 27(suppl 2): ii3ii4 doi:10.1093/ndt/gfs196, FO010

介绍和目的：外泌体是从不同类型的活化细胞分泌的微小囊泡。在肾脏中，外泌体主要由肾细胞释放到尿液。最近的研究表明，外泌体表现表面受体，以及选定模式的mRNA和microRNA的细胞来源。因为尿液是一个现成的流体，它可能是被视为对肾状态的理想信息来源。特别是外泌体似乎可完美反映肾脏不同部份的病理条件。从这个角度来看，外泌体的膜蛋白和RNA含量可能是肾脏病理的有用标记。本研究的目的是建立一个方案，用于外泌体的隔离，与及表面标记和微RNA（miRNA）的含量的定量和分析。

方法：外泌体是从一批健康受试者的尿液中分离出来。在这项研究总共测试了四个外泌体隔离方案，基于1）超速离心（100.000克在4°C为1小时）;2）纳米膜浓缩器AMICON（100K）;3）纳米膜浓缩器Vivaspin 500（Sartorius）; 4）及DTT(200mg/ml)变性TammHorsfall 蛋白质,然后超速离心。外泌体定量以Bradford蛋白质含量法，或以Nanosight计数。mRNA是使用mirVana试剂（Ambion）提取，miRNA以定量RT-PCR进行分析。由于外排体体积小于流式细胞术的灵敏度下限，流式细胞术在被隔离的囊泡吸附在4 Ym的醛硫酸乳胶珠后进行。

结果：以方案2的方法，Bradford测试得出的蛋白质浓度表现出非常低的外泌体浓度。 Nanosight分析显示，使用方案1和2得到高浓度的外泌体（4.7×108和3,5×108外泌体/毫升），而其它两个方案则非常低。从方案1和2得到的外泌体中提取的RNA显示20种miRNA的存在。流式细胞术配合乳胶颗粒的分析，是能够识别的经典外泌体标记（CD63，CD24，CD9）以及肾细胞来源的标记（水信道蛋白，整合素，膜转运蛋白）的存在。

结论：在本研究中，我们确定基于超速离心获得尿液中的外泌体是最合适的方案。比蛋白定量，Nanosight外泌体计数分析更为可靠，这可能是由于尿蛋白的污染。此外，使用乳胶颗粒为基础的流式细胞仪分析，我们发现参与胞吐过程和肾细胞生理的正常尿液中的表面标志物外泌体和一系列miRNA可能与肾细胞功能相关。这些发现对各种各样的肾病机理研究的进一步发展，可以是有效的起点。